Production and characterization of different types of malaria pigment (hemozoin) and their potential use for screening for hemozoin inhibiting drugs

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Malarial pigment, hemozoin, appears to modulate the immune system, however it remains controversial if it has stimulatory or inhibitory effects. Biological properties may depend on the type of hemozoin, namely its origin and production method, morphology or size. Natural hemozoin can be obtained from P. falciparum cultures and identical β-hematin can be synthesized from heme. Characterization becomes crucial to confirm size, shape and possible contaminations. Hemozoin production is also a unique antimalarial drug target. There are several heme inhibition assays to screen for drugs with the potential to inhibit hemozoin growth. Yet, these assays are often complex, use highly concentrated, toxic reagents, and not all confirm the end product’s nature. This work aimed to produce and characterize natural hemozoin and synthetic hemozoin, as well as hemozoin-like crystals. Hemozoin-like crystals growth was also investigated to determine if drugs inhibit crystallization, and adapted in an assay format to explore their potential to screen for hemozoin-inhibiting drugs. Hemozoin obtained from different origins was characterized by several methods, including scanning electron microscopy, X-ray diffraction and infrared spectroscopy. Hemozoin-like crystals were grown in broth medium with different drugs to investigate their ability to inhibit crystallization. Despite an overall similarity in morphology and size, differences were detected and characterized between different types of hemozoin, which may be biologically relevant. Although very similar, X-ray diffraction and infrared spectroscopy showed that hemozoin-like crystals were not true hemozoin. However, inhibition results were consistent with previous heme inhibition studies, with chloroquine and amodiaquine presenting the highest potency, followed by other quinolines such as quinine and mefloquine. In conclusion, hemozoin used in immunology should be thoroughly characterized by several complementary methods. Hemozoin-like crystals growth could be successfully used as a novel assay to screen compounds for their hemozoin inhibiting activity, and may be a helpful tool for antimalarial drug screening.A malária, uma das mais importantes doenças infecciosas da actualidade, permanece um problema de saúde pública a nível global, atingindo regiões tropicais e subtropicais em todo o mundo. Esta doença causa grande morbilidade e mortalidade e contribui para o atraso no desenvolvimento social e económico dos países afectados. A doença é causada por parasitas do género Plasmodium, transmitidos por fêmeas de algumas espécies de mosquito Anopheles. Após a fase sexual no mosquito e a fase hepática do ciclo de vida do parasita no Homem, é durante a fase sanguínea que se manifestam os sintomas da doença febril. Factores do hospedeiro e do parasita poderão contribuir para o desenvolvimento de malária severa, levando eventualmente à morte do doente, sendo que a espécie Plasmodium falciparum é responsável pelo maior número de mortes associadas a malária. Apesar dos esforços travados por organizações internacionais no sentido de combater este flagelo, os programas de controlo e erradicação da malária enfrentam vários obstáculos, como a resistência aos insecticidas usados para impregnar redes mosquiteiras, a inexistência de uma vacina eficaz e, principalmente, a grande disseminação de estirpes de parasitas resistentes aos fármacos anti-maláricos actualmente disponíveis. Ainda que sejam pontuais os relatos de resistência ao quinino, utilizado desde o século XVII, este provoca graves efeitos secundários. Independentemente do sucesso de fármacos sintetizados durante o século passado, compostos como a cloroquina, a mefloquina e os antifolatos são hoje inúteis em muitas regiões do mundo. Não obstante a notável eficácia das artemisininas, estes fármacos podem escassear e tornam-se bastante dispendiosos, devendo ser administrados apenas em combinação com outros, de forma a evitar a propagação de resistência. Assim, é urgente descobrir novos fármacos eficazes no combate à malária. O pigmento malárico, também designado hemozoína, é o produto da desintoxicação de moléculas de heme livre, formado por biocristalização no parasita durante a fase intraeritrocítica, após digestão do conteúdo celular do eritrócito infectado. Pensa-se que fármacos anti-maláricos pertencentes à classe das quinolinas interajam com as moléculas de heme, inibindo este processo de biocristalização e resultando na acumulação de heme livre tóxico responsável pela morte do parasita. Alguns autores defendem que as artemisininas actuam de forma semelhante, apesar de este ser assunto de debate. Esta via de desintoxicação de heme pelo parasita é bastante interessante no desenvolvimento de novos fármacos, já que é exclusivo do parasita e parece ser imutável, devido ao facto de não depender de enzimas codificadas pelo parasita passíveis de sofrer alterações por mutações que estivessem na origem de resistência. Existem várias abordagens para investigação e descoberta de fármacos cujo alvo é a formação da hemozoína. Os ensaios in vitro de inibição da cristalização de heme tentam mimetizar a formação de hemozoína recorrendo à síntese de β-hematina, hemozoína sintética considerada idêntica à hemozoína natural, e permitem identificar compostos com potencial para inibir o crescimento do cristal. Todavia, ensaios diferentes variam grandemente em termos dos resultados que produzem e dos próprios métodos e condições utilizados para a sua realização, e nem sempre são suficientemente reprodutíveis nem de simples execução. O presente estudo teve como objectivo produzir e caracterizar hemozoína de diferentes origens, investigar a capacidade de vários fármacos para inibir o crescimento de cristais semelhantes a hemozoína, e o potencial destes cristais para identificar compostos antimaláricos inibidores da formação de hemozoína. A hemozoína sintética foi obtida por catálise acídica, ao passo que a hemozoína nativa foi obtida quer por purificação, quer por simples extracção a partir de culturas de eritrócitos humanos infectados com P. falciparum. Os cristais semelhantes a hemozoína foram cultivados num meio bem definido suplementado com extracto de sangue. Os cristais produzidos foram caracterizados recorrendo a microscopia óptica, de polarização e microscopia electrónica de varrimento, bem como a difracção raio-X e espectroscopia de infravermelho, e investigados em relação à presença de contaminação por heme, Mycoplasma, DNA ou proteína. Os cristais semelhantes a hemozoína foram ainda cultivados em microplaca na presença ou ausência de vários antibióticos e fármacos antimaláricos. Numa primeira abordagem para a caracterização da hemozoína produzida, que visualmente se apresenta preta em suspensão ou pó seco, a microscopia óptica e de polarização permitiram observar algumas diferenças morfológicas, de cor e depolarização entre os cristais obtidos por diferentes métodos. A microscopia electrónica de varrimento revelou-se talvez o método mais adequado para avaliar a morfologia e homogeneidade, evidenciando a forma de paralelepípedo dos cristais de origem nativa e a forma acicular dos cristais de origem sintética e dos cristais semelhantes a hemozoína. Todavia, apenas recorrendo à difracção raio-X e à espectroscopia de infravermelho foi possível distinguir inequivocamente os cristais semelhantes a hemozoína dos cristais de verdadeira hemozoína. Quando purificada, a hemozoína de origens natural e sintética apresenta ausência dos contaminantes investigados, ao passo que a hemozoína nativa extraída, não purificada, se encontra associada a proteínas e ácidos nucleicos. Ainda assim, e apesar de alguns estudos sugerirem um papel de estimulação do sistema imunitário para a hemozoína, a presença de proteínas e DNA pode ser interessante, caso se considere que a hemozoína poderá ser libertada dentro do vacúolo digestivo intacto ou associada a reminiscências desta ou de outras estruturas do parasita. A contaminação com uma quantidade apreciável de heme em cristais semelhantes a hemozoína contribuiu para estabelecer a diferença relativamente à verdadeira hemozoína. A quantificação realizada com o QuantiChrom™ Heme Assay Kit permitiu tirar partido da optimização para amostras de origem biológica e evita o uso de reagentes tóxicos. A obtenção de hemozoína de origem natural foi morosa e dispendiosa, ao passo que a produção de hemozoína sintética e cristais semelhantes a hemozoína foi mais simples e económica. O IFDO (do inglês Ileal Fluid Dependent Organism) foi descrito por Burdon em 1989 após ter sido isolado do fluido de ileostomia de indivíduos com a doença de Crohn. Além de organismo auto-replicativo, pensou-se poder ser uma espécie de cristal formado por constituintes do meio. Semelhante a priões no respeitante à resistência a desinfecção e esterilização, a empresa Steris interessou-se pelo seu potencial como modelo para investigar este tipo de processos, e confirmada a sua natureza hémica, além da birrefringência e cor castanha, pensou-se que poderia ser hemozoína. Apesar da semelhança, uma caracterização mais completa em colaboração com a Steris revelou a diferença dos cristais, e estes foram então designados cristais semelhantes a hemozoína. A avaliação de compostos anti-maláricos e antibióticos como possíveis inibidores do crescimento dos cristais semelhantes a hemozoína permitiu criar um ensaio in vitro para identificar compostos cujo alvo seja a formação de hemozoína. Observando a microplaca após a incubação do cristal na presença de diferentes concentrações de fármaco, foi possível observar visualmente a presença ou ausência de um precipitado escuro no fundo do poço que indicam respectivamente o crescimento ou a inibição da formação dos cristais semelhantes a hemozoína. O presente trabalho reforça a importância da caracterização da hemozoína obtida a partir de diferentes origens. Deve recorrer-se a vários métodos complementares para avaliação da morfologia, tamanho e identidade dos cristais, e testar a presença de moléculas contaminantes que possam apresentar propriedades químicas e biológicas em estudos imunológicos. Contribuir-se-á desta forma para esclarecer resultados ambíguos na investigação do papel da hemozoína na modulação do sistema imunitário do hospedeiro, bem como na avaliação da actividade de antimaláricos por inibição da formação do cristal. Os resultados obtidos sugerem ainda que o ensaio de inibição do crescimento dos cristais semelhantes a hemozoína pode ser usado a par dos ensaios existentes para testar compostos em relação à sua actividade de inibição da formação de hemozoína. O ensaio de inibição do crescimento dos cristais semelhantes a hemozoína é simples de realizar e requer infraestruturas laboratoriais básicas e reagentes relativamente económicos, podendo contribuir assim para a descoberta de novos antimaláricos e para os esforços no controlo da malária